发布日期：2024-08-29 10:07 点击次数：158
Pal， R.; Lwin， T. M.; Krishnamoorthy， M.; Collins， H. R.; Chan， C. D.; Prilutskiy， A.; Nasrallah， M. P.; Dijkhuis， T. H.; Shukla， S.; Kendall， A. L.; Marshall， M. S.; Carp， S. A.; Hung， Y. P.; Shih， A. R.; Martinez-Lage， M.; Zukerberg， L.; Sadow， P. M.; Faquin， W. C.; Nahed， B. V.; Feng， A. L.; Emerick， K. S.; Mieog， J. S. D.; Vahrmeijer， A. L.; Rajasekaran， K.; Lee【XC-1287】TABOO 明日香， J. Y. K.; Rankin， K. S.; Lozano-Calderon， S.; Varvares， M. A.; Tanabe， K. K.; Kumar， A. T. N. Fluorescence Lifetime of Injected Indocyanine Green as a Universal Marker of Solid Tumours in Patients.
Nat. Biomed. Eng 2023.
https://doi.org/10.1038/s41551-023-01105-2.
Introduction
小序
在往常二十年里，术中肿瘤识别的分子靶向荧光示踪剂和成像系统取得了显耀阐述。现在已开荒出针对肿瘤特异性分子抒发、酶活性或肿瘤微环境荒谬生理情景的荧光探针，何况一些探针已干预后期临床磨砺，以至最近，FDA最近批准了5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和帕呋拉西宁（OTL38）行为首批术中肿瘤显像剂。5-ALA可产生脑肿瘤可见荧光，而OTL38则是一种近红外叶酸受体α靶向荧光团。天然好意思国FDA批准的近红外染料吲哚菁绿（ICG）并非专为肿瘤狡计，但在癌症图像指点手术中得到了庸俗应用。不管接收哪种靶向机制，肿瘤对荧光探针的领受情况王人存在异质性，导致智慧度低、假阳性率高。现存的成像剂在东说念主类多种癌症类型的细胞特异性上尚未得到证实。已毕现存探针性能的一个进击因素是它们与基于荧光强度的成像本领连合使用，而荧光强度取决于肿瘤的大小和深度、染料领受、探伤器后果、照明功率、与目的的距离以过甚他与系统关系的参数，因此，很难对不同成像系统和患者的肿瘤特异性对比度进行迷漫量化，这可能会终止荧光成像在临床上的庸俗应用和手术指点的圭臬化。
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Results完毕
Liver cancer肝癌
盘考东说念主员对原发性和转念性肝肿瘤手术患者进行的实践，盘考发现，在肝细胞癌（HCC）中，肿瘤内的荧光强度不均匀，存在亮区和暗区（图 1a），何况与泛泛组织的荧光有重迭（图 1b）。此外，肿瘤内的荧光寿命（荧光寿命）显著长于周围泛泛肝本色（图 1a 右）。此外，关于分化较差的转念性结直肠癌，荧光强度沿肿瘤限制较高，标明染料在肿瘤周围积贮（图 1e），这种满足是由于 ICG 在肿瘤周围的肝细胞和纤维组织中积贮所致，而荧光寿命则露出，与泛泛肝比拟（0.54 ± 0.01 ns），肿瘤内的荧光寿命（图 1d 右和图 1f）要长得多（0.62 ± 0.002 ns）。为了解释这种满足源自于肿瘤里面的ICG而非组织自觉荧光，作家测定了8名为打针ICG的患者的肝脏肿瘤，完毕标明其之前测定的长荧光寿命如实是来自肿瘤中的 ICG，而细胞层面的荧光寿命成像（FLIM）（图 1g 右和图 1i）也进一步讲明了肿瘤中荧光寿命比泛泛组织的要长。此外，欺诈组织学界说的肿瘤和泛泛肝本色进行肿瘤/泛泛分类的接收器操作特征（ROC）分析欺诈组织学界说的肿瘤和泛泛肝本色进行肿瘤/泛泛分类的接收器操作特征（ROC）分析露出（图 1k 和图 1m ），基于FLM肿瘤识别的准确率（弧线底下积，AUC）为 98%，智慧度为 94.3%（95% 置信区间 (CI) 92-96%）和特异性 95%（95% 置信区间 (CI) 92.7-96.6%）；而对应的基于荧光强度（J = 13.9%）的准确性为 55%，智慧度为 57.3%（95% 置信区间 (CI) 53.1-61.4%）和特异性为 49.8%（95% 置信区间 (CI) 45.3-54.2%）。除了在麻省总病院（MGH）进行的临床盘考外，作家还追忆性地查验了莱顿大学之前进行的 ICG 临床磨砺的 mCRC 患者标本（n = 3），并发现肿瘤荧光寿命显著增多，天然还需要进一步盘考细则肝脏肿瘤最好分类性能的剂量和打针时间，但这些数据撑抓肝脏肿瘤中荧光寿命增强的细胞着手，以及使用荧光寿命比荧光强度更高的肿瘤与泛泛分类性能准确性。
图1. a）患者刚切除的 HCC 标本的相片、荧光强度和荧光寿命图，b，c） Violin 图露出了肿瘤和泛泛肝各像素的强度（b）和 荧光寿命（c）散布。虚线默示临床细则的肿瘤限制。e，f）露出了 d 所示标本中肿瘤和泛泛肝像素的强度（e）和 荧光寿命（f）散布。h、i）Violin 图露出了 g 中所示标本中经组织学证实的肿瘤限制（g 中的黄线）、发炎的基质和泛泛肝细胞区域内各像素的强度（h）和 荧光寿命（i）散布情况。j）g 中泛泛组织和 HCC 组织区域的高分辨率（20 倍放大率）组织学图像（左列）、荧光强度图像（中列）和荧光寿命图像（右列）。k，l）g 中组织学界说的肿瘤限制内（红色）和限制外（绿色）的荧光强度（k）和 荧光寿命（l）直方图。m）g 中标本中肿瘤与泛泛组织分类的 ROC 弧线，基于 荧光寿命（红色）和强度（绿色）分类的准确率（AUC）分别为 98% 和 55%。灰色暗影区域代表 95% 的置信区间。n）肿瘤细胞（玄色）和泛泛肝细胞（灰色）的代表性 TD 荧光衰减弧线。
Head and neck cancer
头颈部癌症
在8例头颈部（HN）癌症患者的口腔鳞状细胞癌（OSCC）标本中【XC-1287】TABOO 明日香，有7例露出肿瘤中的荧光寿命比拟泛泛组织更长，唯唯一个荒谬的纺锤形细胞癌患者例外。荧光图像露出长荧光寿命局限于肿瘤限制内，而无肿瘤组织的荧光强度和荧光寿命相对较低。由于无法获取包含肿瘤和泛泛组织的全侧切片，对HN标本的宽视线图像未能进行组织学验证，因此，盘考东说念主员将从头鲜标本切下的组织横截面（约10微米）的FLIM与疏浚切片的组织学进行了比较，以验证荧光寿命增强的显微特异性。在FLIM图像中，不雅察到了荧光寿命较长的区域与组织学图像上浸润肿瘤细胞的显微巢之间近乎。
多名HN癌患者的共聚焦显微镜数据标明，泛泛组织中有大宗ICG保留，肌肉、血管、泛泛基质的荧光强度与肿瘤、发育不良和肿瘤浸润淋巴细胞十分。关联词，在悉数患者中，肿瘤、发育不良上皮细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的荧光寿命比几种泛泛组织类型要长得多。ROC分析露出，使用荧光寿命对肿瘤与泛泛组织分类的准确率为98%，而使用强度进行分类的准确率为63.3%，比拟之下，基于强度的分类的准确度、智慧度和特异度显著低于基于荧光寿命的分类。
此外，对使用较高ICG剂量（5 mg/kg）的HN手术患者标本进行了评估，完毕露出肿瘤荧光寿命仍然显著增多，但泛泛组织荧光寿命也相应升高，这可能与高剂量ICG未完全撤废洽商。
图2. a-c）SCC患者的彩色相片（左）、宽场荧光强度（中）和荧光寿命图（右），他们分别患有左耳皮肤 SCC（a）、舌头口腔 SCC（b）和组织学上无肿瘤的舌头标本（c）。d，e）左下颌 OSCC 标本（d）和舌 OSCC 标本（e）的组织学、显微荧光强度和 FLIM。f）在舌部的 OSCC 标本中，与浸润性肿瘤相邻的增生不良上皮中也不雅察到与肿瘤细胞十分的长荧光寿命值。g，h）舌 SCC 标本中肿瘤（红色）和泛泛组织（绿色）内的荧光强度（g）和 荧光寿命（h）直方图露出。i，j）每个患者（n = 7）的肿瘤（红色）和泛泛组织（绿色）的平均荧光强度（i）和 荧光寿命（j）露出为组织学飘舞的肿瘤和泛泛组织的多个 ROI（大于 40）的平均值。k，l） Violin 图露出多个患者（n = 7）HN 肿瘤和泛泛组织类型中荧光强度（k）和 荧光寿命（l）的散布。NE，泛泛上皮；NS，泛泛基质；DS，脱鳞基质；SG，唾液腺。m）OSCC 肿瘤和泛泛口腔肌肉组织的代表性 TD 衰减弧线。n）悉数盘考患者（n = 7）的智慧度与假阳性率（1 - 特异性）的 ROC 图。
Bone and soft tissue cancers
骨和软组织癌症
针对骨和软组织癌症的盘考，作家聘请了包括原发性赘瘤和转念性结肠、乳腺以及肾癌等临床样本。完毕标明，尽管在荧光强度图像（图 3b、g、l）中不错看到出血区、纤维组织和肌肉中存在较高的非特异性 ICG 领受，关联词在荧光寿命图像中不错看到原发性赘瘤以及肾癌和乳腺癌的骨转念荧光寿命王人有显著的增强，尽管在荧光强度图像中存在非特异性 ICG 领受。道理的是，又名子宫肌瘤患者，即使在术前麻醉诱导时打针 ICG，也能不雅察到十分大的肿瘤与泛泛荧光寿命对比。
按患者进行的分析露出，不同患者的平均荧光强度各别很大，其中三名患者泛泛组织的荧光强度高于肿瘤。关联词，悉数患者的平均肿瘤荧光寿命王人显著长于泛泛组织 荧光寿命。ROC 分析露出，基于荧光寿命的肿瘤与泛泛分类的准确率、智慧度和特异性高于基于强度的分类。关于接受新接济放疗或化疗的赘瘤患者，肿瘤限制表里出现不均匀的 ICG 领受，导致肿瘤与泛泛强度对比度较低。关联词在悉数接受调解的患者标本中，存活肿瘤区域内荧光寿命一致长于泛泛组织。
图3. a-e）又名打针了 ICG的患者的子宫肌层赘瘤标本中的荧光寿命图。f-j）骨赘瘤中的荧光寿命图。k-o）肾转念至骨的荧光寿命图。p，q）肿瘤（红色）和泛泛组织（绿色）的患者（n = 8）平均荧光强度（p）和 荧光寿命（q）r，s） Violin 图，露出多名患者（n = 10）赘瘤癌细胞和几种泛泛组织类型的荧光强度（r）和 荧光寿命（s）的散布情况。BV，血管；CT，结缔组织；AT，脂肪组织。t）十名患者标本数据中肿瘤与泛泛分类智慧度与 1 - 特异性的 ROC 图。
Brain tumours肿瘤
脑肿瘤胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度浸润性的肿瘤。在接受GBM手术的患者中，输注5毫克/千克的ICG后，福尔马林固定的标本进行成像。与共聚焦组织学和荧光强度图像比拟，荧光寿命图像露出肿瘤细胞和出血区域的ICG荧光强度较高，且唯独在肿瘤区域不雅察到显著较长的荧光寿命。比拟于其他赘瘤或头颈癌，GBM中的坏死瘤核显走漏更高的ICG保留率和较长的荧光寿命。
针对GBM标本，通过评分反馈肿瘤细胞密度，将获取的ROI分红无、低、中、高四个组织学组。各组的ICG荧光强度十分，但荧光寿命从低密度ROI到高密度ROI冉冉增多，导致平均荧光寿命与肿瘤密度呈很强的正关系。
患者间ROC分析，将无肿瘤和低密度ROI组劝诱为阴性组，将中度和高密度ROI组劝诱为阳性组。ROC弧线完毕露出，基于荧光寿命的分类准确率为97.5%，智慧度为90.7%，特异性为96.2%（J = 84.3%）；而基于荧光强度的分类准确率为33%，智慧度为53%，特异性为20%（J = 26.9%）。
总的来说，对接受ICG打针的GBM标本进行荧光寿命测量，或者准确诀别中高密度区与低密度区（或无肿瘤区），可用于在GBM手术中细则肿瘤的浸润限制。
图4. a、b）两名患者的高档别 GBM 10 µm FFPE 组织切片的组织学（左）、荧光强度（中）和 FLIM（右）。c-f）四个组织学类别的代表性组织学图像（上排）、荧光强度图像（中排）和荧光寿命图像（下排），即无肿瘤（c）、低密度（d）、中等密度（e）和高密度（f）。i） 使用 荧光寿命（红色）和强度（绿色）的智慧度与 1 - 特异性的 ROC 弧线。
Detecting metastatic LNs
检测转念性淋阿谀
除了对原发性肿瘤进行准确的角落检测外，在手术历程中对肿瘤阳性 LN 和阴性 LN 进行有用诀别也十分进击。作家通过对接受颈部根治性切除术的患者进行荧光寿命成像，发现其中一个LN的ICG 荧光寿命较长，经组织学证据为恶性；而荧光寿命较短的LN则经组织学证据为良性。共聚焦FLIM图像进一步证实了成像完毕，露出荧光寿命较长的LN含有转念性肿瘤结节，而荧光寿命较短的LN莫得肿瘤浸润的迹象。此外，在又名行肝部分切除术的转念性结肠癌（mCRC）患者中，切除的区域LN也显走漏近似的荧光寿命增强，与组织学证实的转念性肿瘤结节相符。总的来说，作家对13个LN进行了评估，除了一个未露出ICG领受的阳性LN外，其余12个LN王人能通过FLIM准确识别。8个阳性LN在浸润肿瘤巢内显走漏长荧光寿命。而悉数阴性的泛泛淋阿谀露出了来自血管的高ICG荧光强度，且其荧光寿命相对较短。
图5. a）又名口腔 SCC 患者在颈部根治性切除术中切除的 LN 标本相片。b）悉数这个词标本的广域荧光寿命图像露出.0。c-h）所示为肿瘤阳性 LN 组织切片的组织学（c，d）、荧光强度（e，f）和 FLIM（g，h）图像。i-n）肿瘤阴性 LN 组织切片的组织学（i，j）、荧光强度（k，l）和 FLIM（m，n）图像露出血管中 ICG 强度高但荧光寿命短（i，k 和 m 中的箭头）。j、l 、n ）分别是 i、k 和 m 中所勾勒的 ROI 的放大图。r-t）p 和 q 中矩形区域 "1 "的组织学（r）、荧光强度（s）和 FLIM（t）露出。u-w）p 和 q 中 "2 "区域的组织学和 FLIM（肿瘤限制外）显走漏与 "1 "区域十分的强度（v），但 荧光寿命（w）较短，与组织学（u）中 "2 "区域莫得肿瘤细胞相对应。x-z）团结患者另一个淋阿谀切片的 FLIM（未露出广域荧光寿命图像），露出转念癌细胞巢（x，箭头），强度高（y，箭头），荧光寿命 长（z，箭头），周围是泛泛淋巴组织，荧光寿命短。
机制
Mechanism
为了细则ICG在癌细胞中FL增强的因素，作家对多个东说念主类癌细胞系（HepG2、U2OS、HT29和MDA-MB-231）进行了验证，完毕标明，尽管ICG的领受和荧光强度真实疏浚，关联词肿瘤细胞中ICG的荧光寿命比泛泛细胞系（MCF 10A）长。此外，ICG在干预癌细胞后会在溶酶体内富集，而肿瘤细胞内偏酸性的环境可能是荧光寿命增强的诱导因素之一，关联词这一猜念念在进一步的pH实践中被诡辩。另外，ICG的荧光寿命会跟着溶剂粘度的增多而改换，而癌细胞内的较高细胞粘度可能会在影响ICG的荧光寿命。除了组织环境参数外，ICG与血清卵白连合也会增多其的荧光量子产率。在实践条目下，ICG的荧光量子产率与浓度关系不大，但跟着浓度升高，荧光强度增多。此外，当有胎牛血清时，ICG的荧光强度和寿命王人会增多，这是因为ICG与白卵白连合后环境的特色发生了变化。成像实践证实了血清卵白连合对肿瘤细胞内ICG荧光特色的影响，标明了在肿瘤细胞中不雅察到的荧光寿命增强可能是ICG与血清卵白连合和肿瘤细胞相干于泛泛细胞具有较高细胞内粘度的空洞完毕。
图6. a）在无血清（FBS）培养基中滋长的 HepG2 和 MCF 10A 细胞的代表性荧光强度和荧光寿命图像。b）在无血清培养基中，癌细胞 HT29（红色）和泛泛细胞 MCF 10A （绿色）细胞质中的代表性荧光衰减弧线。c）各式癌细胞（U2OS，红色；HT29，淡蓝色；HepG2，黄色；MDA MB 231，蓝色）胞质中荧光寿命散布直方图与 MCF 10A 中荧光寿命散布（绿色）的比较。d）U2OS 赘瘤细胞荧结拜微镜不雅察，露出 ICG 与细胞孵育 1 小时后定位于溶酶体中。蓝色：核染色（DAPI）；绿色：溶酶体染色（LysoTracker Deep Red）；红色：ICG；黄色：共定位：e）笔据多个像素点上 LysoTracker 和 ICG 荧光强度的关系性（R = 0.87）测量 ICG 与溶酶体的共定位分析。f）ICG荧光寿命与溶剂粘度的关系。h-l） ICG荧光寿命与血清卵白连合的关系。
Discussion
论断
这篇盘验解释使用ICG行为通用成像璀璨物对多种实体瘤进行成像是具有临床应用远景的。临床数据露出，从皮肤、口腔、肝脏、结直肠、骨骼等多种实体瘤中ICG的荧光寿命显著长于泛泛组织。共聚焦FLIM本领不错高分辨率地分析单个肿瘤细胞，对良性和恶性淋阿谀以及大型切除标本中的肿瘤和泛泛组织进行分类，准确率向上97%。
盘考还发现，除了肿瘤外，某些非肿瘤组织也可能呈现出与肿瘤荧光寿命十分的增强。这是因为一些因素，如TILs和纤维瘤囊，露出了与肿瘤近似的荧光寿命对比度。此外，盘考揭示了ICG在癌细胞里面的内化机制，并与溶酶体共定位。荧光寿命的变化与粘度密切关系，癌细胞内溶酶体的高粘度可能导致ICG的荧光寿命增强。
临了【XC-1287】TABOO 明日香，盘考提倡了在临床奉行中欺诈荧光寿命成像的远景。通过设定适合的荧光寿命阈值，不错快速、准确地细则手术切除角落，同期对大型标本进行自动化空洞病理评估，为临床调解提供了新的可能性。近红外荧光寿命成像在癌症调解中的庸俗应用远景也被强调，涵盖了会诊、术中指点和术后组织病理学等多个方面。